1、細(xì)胞凍存前12~24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞一直處于對數(shù)生長期。

　　2、待細(xì)胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細(xì)胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細(xì)胞則直接離心。

　　3、棄上清，加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細(xì)胞懸液分至凍存管內(nèi)，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期等。（細(xì)胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件調(diào)整）

　　4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃過夜，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于最低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

　　5、細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，再繼續(xù)凍存。