PCR實驗原理介紹
發表時間：2021-05-27
PCR實驗概述
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進行定量的有力工具。隨著分子生物學技術研究的不斷進展，定量PCR技術取得了突飛猛進的發展，實時定量PCR (real-timequantitative PCR)技術便是一種具有意義的定量PCR技術。所謂實時定量PCR是指在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量。
PCR實驗原理介紹
TaqMan熒光探針
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成同步。
SYBR Green熒光染料
SYBR Green是一種DNA結合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態下，它不發出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后，便可以發出熒光。它的大優點就是可以與引物、模板相配合，用于反應體系中。從經濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與的雙鏈DNA結合，所以一旦反應體系中出現非特異擴增，那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優化反應條件以消除非特異性影響。
步驟如下：
1. 設計并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG（SYBR® Green）的PCR反應的優化。
3. 客戶樣品RNA抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4. RNA質量檢測
a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度
b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5. 使用逆轉錄酶（Promega）進行反應，將樣品RNA逆轉錄為cDNA。
6. 制備標準曲線樣品：
進行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增，其產物進行梯度稀釋用于做標準曲線。
7. 標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應液中（其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司），進行RealTime PCR擴增和檢測。
8. 檢測結果進行標準曲線分析：以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的基因相對含量
